MICROPROPAGACION VEGETAL

·    Micropropagación Vegetal

·         Ingeniero Agrónomo Jorge J. Namur

·         Auxiliar Docente de la Cátedra de Caña de Azúcar

·         Laboratorio de Cultivo de Tejido Vegetal

·         Cátedra caña de azúcar

·         FAZ- UNT

·         Como la etimología de su nombre lo indica, consiste en la multiplicación vegetal  a partir de pequeñas porciones de tejido, incluso partiendo también de células aisladas, alude además al reducido espacio necesario para su práctica; mientras que la denominación de “Cultivo in vitro”  hace referencia en forma más amplia al  cultivo en medio nutritivo, en recipientes de vidrio, bajo condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores (pero también de células y tejidos animales). Cualquiera de estas porciones de tejidos antes citadas a las que podemos agregar semillas, óvulos y anteras, reciben el genérico denominativo de explantes.

·         Cultivo de tejido vegetal: se refiere al cultivo in vitro de partes de la planta (tejidos o frecuentemente órganos)

·         A través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia.

·         Este proceso de micropropagación incluye cinco fases:

·         Fase 0) Preparación de la planta madre (La fase 0 reviste gran importancia puesto que implica una cuarentena para determinar el grado de sanidad de las plantas donantes. En esta etapa se realizan estudios mediante pruebas serológicas debido a que pueden ser portadoras de enfermedades endófitas que pasando desapercibidas, se vuelven un problema en la etapa de la multiplicación. También es fundamental el conocimiento cierto de su identidad genética como así mismo su vigor: sanidad, identidad y vigor son requisitos básicos para la obtención de cultivares confiables.)

·         Fase 1) Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

·         Fase 2) Multiplicación de brotes

·         Fase 3) Enraizamiento

·         Fase 4) Aclimatación

·        En 1974 Murashige definió cuatro fases dentro del cultivo in vitro:

·         Establecimiento del cultivo:

·        El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extraídos de la planta madre. Estos pequeños órganos o trozos de tejido se llaman explantos. Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas por microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente se introducirán en el medio a su vez estéril y se mantendrán allí en condiciones asépticas.

·         Multiplicación:

·        Una vez que la primera fase se ha completado con éxito, comienza la multiplicación de los explantos. El explanto encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales, azúcares, hormonas, etc.). Tras un período de crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se produce la multiplicación de las plantas.

·         Enraizamiento:

·        Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario proporcionarles una raíz con la que sean capaces de realizar sus actividades vitales una vez que se encuentren de nuevo en el medio natural. La inducción de estas raíces se produce modificando ligeramente las características del medio de cultivo adecuándolas para la generación de raíces.

·         Aclimatación: esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran número de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo están en una atmósfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se caracterizará por tener menos ceras que protejan a las plantas contra la deshidratación. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se efectuará por tanto cuidadosamente, utililizando para ello invernaderos.

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·         Historia

·         El fisiólogo vegetal alemán Haberlandt dejó sentadas las bases para el desarrollo de la micropropagación en 1902 al enunciar su teoría de la toti potencialidad celular, la que dice que: “cualquier célula vegetal  lleva intrínseca  la potencialidad de reproducir a partir de sí   un individuo idéntico a aquel que le dio origen”,   lo que podría ocurrir a partir de una célula y aún más,  aunque esta proviniera de la raíz por ejemplo,  incluso  granos de polen, llegarían a posteriori  de sucesivas divisiones bajo cultivo a reorganizar un individuo completo e idéntico a aquel del cual proviene la célula donante, salvo que tratándose de células sexuales como en el último de los ejemplos citados, la descendencia sería haploide por provenir de células sexuales. Hecho que reviste importancia en el proceso de mejoramiento por la obtención de individuos genéticamente modificados.

·         En 1922 Knudson obtuvo la germinación de simientes de orquídeas en medios sintéticos (cultivo asimbiótico).   Morel   en 1960 sentó las bases de lo que hoy se conoce como clonación al lograr sanear meristemas de Cymbidium (Orquidáceas) contaminados de virus logrando a partir de los mismos la proliferación de masas de protocormos, los que pueden ser divididos y vueltos a cultivar para regenerar nuevas plantas. Esto dio un gran impulso al cultivo de las mismas ya que los sistemas tradicionales de multiplicación vegetativa  son extremadamente lentos.

·         Definición

·         Se puede definir a la micropropagación como:” un conjunto de técnicas heterogéneas que consiste en aislar y cultivar en medios de composición conocida y en condiciones de asepsia un explanto bajo temperatura, humedad y luz controladas.”

·      Usos

·         La propagación rápida en masa de clones (mejoramiento genético)

·         El desarrollo, mantenimiento y distribución de clones específicos probados para organismos patógenos.

·         Es una herramienta imprescindible para la obtención de individuos transgénicos.

·         Saneamiento y regeneración de cultivares perennes(caña de azúcar, cítricos, papa)

·         Etcétera.

·      Desventajas

·         Alto costo de instalaciones.

·         Necesidad  de mano de obra altamente especializada y capacitada

·         Aparición de mutaciones desapercibidas que podrían multiplicarse a una escala elevada en corto tiempo.

·      Tipos de regeneración

·         Alargamiento de puntas de meristemáticas

·         Producción axilar de ramas

·         Iniciación adventicia de ramas

·         Organogénesis

·         Embriogénesis

·         Instalaciones y equipamiento

·         Existen diferentes tipos de instalaciones de acuerdo a su propósito: podría tratarse de un laboratorio de investigación sobre la micropropagación, lo que exige una importante inversión en instrumental y tecnología. O bien de un laboratorio con fines de multiplicación comercial a gran escala (se habla de fábricas de plantas o biofábricas) o bien de un pequeño laboratorio con fines comerciales o de investigación.

·         Pero básicamente se necesitan para las operaciones de cultivo en  cualquiera de los casos, tres y hasta cuatro sectores si se incluye el de aclimatación: Área de preparación, área de transferencia, área de cultivo y área de aclimatación.

·         Área de preparación

·         Es en esencia una cocina donde:

·         Se limpian objetos de vidrio

·         Se preparan y esterilizan los medios de cultivo

·         Se almacenan y suministran los materiales de vidrio.

·         Debería contar con: refrigerador para conservación de sustancias químicas en especial hormonas o reguladores de crecimiento, vitaminas y pequeñas cantidades de medios de cultivo. Balanza analítica. Autoclave. Pehachímetro. Calentadores de gas o eléctricos. Filtros para depuración de sustancias termolábiles. Destilador para provisión de agua.

·         Área de transferencia

·         Ambiente estéril donde se realizan las operaciones para introducir los explantes en los medios de cultivo. Al propósito, la Cámara de Flujo Laminar filtra el aire hasta  eliminar sus impurezas y logra un área de trabajo aséptica. Generalmente se utiliza luz ultravioleta para la esterilización del aire del lugar de trabajo.

·         Área de crecimiento

·         Con control luminoso tanto de la intensidad (alrededor de 1000 lux de luz fría) como de la duración del fotoperiodo (generalmente de 16 horas). Control de la temperatura de cultivo que está en general alrededor de los 25 °C. Y la humedad ambiente en el interior de la cámara superior al  50%. Se pueden usar también shaker o agitadores para la aireación de los medios durante el cultivo en medios líquidos.

·         Área de aclimatación

·         Los nuevos individuos regenerados en el cultivo in vitro tendrán en un cierto tiempo el tamaño adecuado para abandonar esta etapa de cultivo y pasar a posteriori a condiciones de cultivo normal  de campo o in vivo. Pero durante la fase del CV las mismas estuvieron siendo tratadas casi como organismos heterótrofos al suministrarles de manera exógena como constituyentes de los medios de cultivo los hidratos de carbono que en condiciones naturales hubiera producido per se al ser autótrofas. La luz no se suprime totalmente  en esa fase para que la célula diferenciada no pierda su capacidad fotosintética.

·         Pero aclimatarlas presupone un desafío al tener que enfrentar condiciones de humedad muy inferiores a las que existían en el interior de los vidrios donde era del 100 %, de temperaturas variables diferentes a las constantes e ideales para el funcionamiento celular que era de 25°C, y una luminosidad muchas veces mayor a las que venía recibiendo.

·         Para este propósito la lógica nos lleva a suponer que debe haber un período de aclimatación o adaptación hasta que los nuevos ejemplares acepten condiciones de cultivo estresantes.

·         Una instalación para cumplir con este propósito será  un invernadero  donde se pueda lograr temperaturas controladas, humedecimiento por medio de un sistema de niebla automatizado y luminosidad que permita ir variándola desde un 10% al 100% de luz solar directa en forma creciente y paulatinamente.

·         Equipamiento

·         Se habló de la cámara de flujo laminar, del autoclave, de balanza analítica, peachímetro, además son necesario los vidrios del tipo de instrumental de  laboratorio para las mediciones de precisión al elaborar los medios de cultivo y los botes propiamente dichos al que deben su nombre el sistema de cultivo. Además de la dotación de drogas necesarias para suplir la necesidades en la preparación de los medios. Debe tenerse en cuenta que también como parte de este equipamiento se puede incluir aire acondicionado para las  cámaras de cultivo tanto como para el área de transferencia que debe tener una atmosfera lo más aislada posible de las condiciones externas en las que la presión de los inoculo de potenciales contaminantes del cultivo es muy elevada, como así también para el mantenimiento de la temperatura en el área de incubación. Los sistemas de iluminación de luz fría llevan temporizadores automatizados.

·         MEDIO DE CULTIVO

·         Es la combinación sólida o líquida  de nutrientes y agua. Incluye sales inorgánicas, carbohidratos, vitaminas y aminoácidos. Se le denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias, según las necesidades de la etapa de cultivo.

·         Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones

·         Agua

·         Sustancias orgánicas: Azúcares,   Aminoácidos, Vitaminas, Auxinas,  Cito quininas,  Giberelinas,  Acido abcísico

·         Macro elementos: N,  P,  K,  Ca, S,  Mg.

·         Micro elementos: Fe, Zn, B,  Mn, Cu, Ni, Co,  Al, Mo, I.

·         Mezclas de sustancias:

·         Algunos compuestos empleados son sustancias orgánicas de composición compleja tal es el caso de: Extracto de levadura, leche de coco, extractos vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona

·         El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente para regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio a estas se las denomina con el nombre de sus creadores y el agregado de modificado y el año de creación de esa modificación.

·         El medio WPM (1980) de menor concentración de sales  está especialmente indicado para especies leñosas. Existen numerosos medios con variados propósitos.

·         Tipos de medios de Cultivo

·         Medio sólido: es todo aquel que contiene un agente gelificante. La dureza del medio depende de 2 factores:

·         PH

·         Composición química del medio

·         El gelificante más usados en el cultivo in vitro es el agar: Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. La planta no puede digerirlo ni adsorberlo,  y no interactúa con los componentes nutritivos del medio. El agar se funde a altas T (96⁰C), solidifica alrededor de los 40⁰C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una concentración de 0,6 - 1%. El principal problema  es su elevado costo

·         Medio líquido: sin adicionado de ningún gelificante.

·         Su uso  ofrece las siguientes ventajas e inconvenientes respecto al uso de medio sólido:

·         Facilita la absorción de nutrientes por el explanto.

·         Es más fácil la manipulación para cambiar medios.

·         Cualquier exudado de la planta se diluye con mayor facilidad.

·         Algunas especies que crecen mal en medio líquido.

·         Si resulta posible el cultivo en medio líquido, se debe considerar el problema de la aireación. Se puede cultivar el explanto parcialmente sumergido, y si se necesita una inmersión total se debe utilizar un agitador.

·         El control del PH inicial del medio y de su dinámica durante el cultivo tiene una gran importancia en el desarrollo de cualquier proyecto de cultivo in vitro.

·         A pesar de su importancia, en muchos experimentos este control se limita a fijar su valor inicial sin reparar en los posibles efectos de su dinámica.

·         Tipos de cultivo in vitro

·         Las condiciones de cultivo pueden ocasionar la proliferación desorganizada de las células del explanto hasta dar lugar a un callo o incluso a un cultivo de células cuando se separan éstas del callo.

·         Si se elimina la pared celular de las células se obtiene un cultivo de protoplastos.

·         En otros casos se puede pretender la regeneración de la planta completa (morfogénesis) mediante la formación de raíces (rizo génesis) y/o de tallos.

·         La morfogénesis se produce a partir del explanto inicial mediante la formación de raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal (adventicias/os).

·         En estas etapas es común el uso de hormonas vegetales o de reguladores de crecimiento.

·         La morfogénesis puede ser:

·         morfogénesis indirecta: se produce después de la formación de un callo

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·          Éste es un conjunto de células indiferenciadas. Recién a partir de ellas se regenera la nueva planta.

·         morfogénesis  directa: se produce directamente del explanto sin que este pase por una fase de callo

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·         Embriones somáticos: Surgen cuando en el explanto se producen unas estructuras bipolares que presentan las propiedades morfológicas de los embriones zigóticos.

·         Según que estos embriones somáticos surjan directamente del explanto o bien de un callo se habla de embriogénesis directa o indirecta, respectivamente.

·         Reguladores de Crecimiento, Hormonas vegetales
Se entiende por hormonas vegetales
aquellas substancias que son sintetizadas en un determinado lugar de la planta
y se translocan a otro, donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando
el crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal. El término "substancias
reguladoras del crecimiento" es más general y abarca a las substancias
tanto de origen natural como sintetizadas en laboratorio que determinan respuestas
a nivel de crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos:
1 Auxinas
2 Citokininas
3 Giberelinas
4 Etileno
5 Acido abcísico

·         Su empleo se realiza a veces de a una o en otros casos en una relación variable según la etapa del cultivo

·         Elección del explanto

·         Se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado para lo cual  es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a  cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperiodo y de la irradiación recibida. A estas plantas se las denomina plantas donantes.

·         Escogida la planta madre o donante, se extraerán los fragmentos, los cuales son desinfectados para luego obtener los explantes.

·         En condiciones de asepsia (en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes

·         un códigLa razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta. Existen otros factores:

·         El meristemo apical tiene una >  velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanza" al meristemo.

·         En una célula meristemática el virus tiene > dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estás células tienen o de trabajo muy definido.

·         Cultivo de meristemas

·         Se usa principalmente con el fin de limpiar o liberar de virus cultivares afectados por enfermedades virósicas.

·         Es el cultivo in vitro del  meristema apical que como media mide 100x100 µm más los primeros primordios foliares.

·         El cultivo de  meristemas es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y es el material preferido para la conservación de germoplasma

·         La razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el meristema carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan mediante el flujo de la savia vegetal los virus que van contaminando a la planta. Existen otros factores que han intentado explicar los mecanismos por los cuales la metodología sirve para la liberación de virus:

·         El meristema apical tiene una mayor  velocidad de crecimiento en relación a la eficiencia de propagación del virus y en consecuencia este "no alcanza" al mismo.

·         En una célula meristemática el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estás células tienen un código de trabajo muy definido.

·         Desinfección de explantes

·         Comienza generalmente con una inmersión o una aspersión con alcohol 70%, luego con un lavado con detergente, una inmersión en hipoclorito de Na al 20 o 30 % para eliminar así los patógenos superficiales. El tratamiento con el hipoclorito puede necesitar de unos treinta minutos de inmersión con agitación. Luego de remover algunas partes y ya en el interior del flujo laminar se procede a despejar el explanto propiamente dicho que consiste en una porción mínima de tejido y se pasa éste por una segunda inmersión en hipoclorito al 5 % unos 10´’. Finalmente se lavan con agua estéril antes de colocarse en el medio de cultivo y comenzar su incubación.

·         Siembra en Cámara de Flujo laminar

·         Consiste en una unidad de filtrado del aire al que expele por la presión producida por

·         un motor.

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·         Ejemplos de interés agronómico

·         Aunque cualquier cultivo puede tener interés por diversas razones, en especial la de mejoramiento genético y también las de ingeniería genética, pero es en especial en aquellos cultivos perennes y de propagación vegetativa en donde es de mayor importancia puesto que la propagación de enfermedades en estos casos es mayor. Tal es el caso de la caña de azúcar, papa, bananero, ajo, batata, orquídeas y muchos otros. En el caso de caña de azúcar el declina miento del cultivar se relaciona con los sistemas de cosecha que propagan las enfermedades virales y bacterianas con las herramientas de corte y cosecha. La papa encuentra inconvenientes en la presencia de insectos vectores o áfidos que son los que propagan los virus en la plantación y al ser usadas luego como plantas semillas su multiplicación se ve potenciada.

·         Consideraciones sobre la FASE 4: RUSTICACIÓN

·         Rusticación

·         Según la real academia española, rusticación es el acto de rusticar, definiendo rusticar por:

·         Salir al campo, habitar en él, sea por distracción o recreo, sea por recobrar o fortalecer la salud.

·         En tanto que por Aclimatación  se acepta en un término más amplio como un proceso por el cual un organismo se adapta fisiológicamente a los cambios en su medio ambiente, que en general tienen relación directa con el clima. Se suele usar este término para referirse a procesos que ocurren durante un período corto, como la vida de un organismo individual o grupo. En algunos organismos la aclimatación ocurre en ciclos periódicos, como el crecimiento del pelo que experimentan algunos mamíferos durante el invierno. Algunos distinguen entre aclimatación y aclimación, entendiendo que esta última hace referencia a un proceso forzado de adaptación por medios artificiales. Por ejemplo: el oso empieza en invernación y se adapta al cambio de temperatura y debido a eso le crece el pelo para mantenerse caliente todo el invierno y en primavera se le cae algo de ese pelo para no calentarse mucho.

·         Por lo que al hablar de este proceso es más preciso referirla al término rusticación.

·         Por complejo que parezca lo relativo al cultivo in vitro, respecto a las condiciones de asepsia y ambientales controladas en las que se realiza, muchas veces resulta fácil frente al desafío que pre supone la llamada rusticación.

·         Esta última etapa del proceso de multiplicación in vitro  consiste en adaptar plantas cultivadas por período prolongados (entre seis meses a dos y más años) en cámaras de cultivo con condiciones ambientales controladas, para RUSTICACION  de por medio, lograr que se adapten a tolerar  condiciones ambientales estresantes. El  proceso no puede realizarse bruscamente, sino que por el  contrario debe ser paulatino, so pena de perder todo el trabajo previo.

·         Plantas que venían al 10 % de la luz solar directa convendría pasarlas a un 20 % por un período de entre quince días y un mes, o más dependiendo de la especie, luego pasarlas a un 50 % de luz solar por otro período de tiempo similar para finalmente llegar a exponerlas a pleno sol.

·         El tiempo será variable, según las especies cultivadas.

·         Durante el proceso de cultivo en cámaras de incubación, las plantas son tratadas en contra de su naturaleza autótrofa, alimentándoles  con sacarosa en los medios de cultivo, o sea tratándolas como heterótrofas. Al suministrarle sacarosa al medio de cultivo, la planta la tomará vía celular directamente del medio y respecto a la irradiación lumínica que reciben, se reducen a apenas un 10 % de la existente en la atmósfera, tan solo como para que las plantas no pierdan su facultad autotrófica ya que el resto de sus necesidades energéticas las suple con la disponibilidad de sacarosa antes mencionada. También el control del período luminoso en estas condiciones permite llevar a diez y seis horas luz diarios continuo.

·         La humedad en interior de los frascos de cultivo está al límite de la humedad de saturación. Se presupone que al noventa y nueve por ciento.

·         El proceso de rusticación debe tener en cuenta que haremos el pasaje de plantas cultivadas en condiciones artificiales estables y asepsia total a condiciones naturales variables y contaminantes potenciales presentes.

·    Aclimatación  o Rusticación

·         Plantas cultivadas in vitro                                                           Plantas rusticadas

·         Iluminación

·         10 % luz solar directa                                                                 50 %  a 100% de luz solar

·         Modo de alimentación

·         Casi HETERÓTROFO                                                               AUTÓTROFO

·         Temperaturas de mantenimiento

·         25 °C (+o -  2°C)                                                                           entre 0 y 40 °C

·         Humedad relativa del aire

·         99 %                                                                                                 20% y 99 %

·         Sanidad de los medios de Cultivo

·         ESTERIL                                                                 Altamente CONTAMINANTE

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·         De hecho que un cambio drástico en las condiciones de cultivo ocasionaría cuantiosas pérdidas y/o retrasos en el crecimiento de las plantas.

·         Por lo antes expuesto, se impone realizar el pasaje en forma gradual hasta que la planta se adapte a las nuevas condiciones ex vitro.

·         El proceso de rusticación debe comenzar con un sombreado en el invernadero del 80 %. Y la introducción de las mismas en una cámara húmeda al 99 % de humedad relativa con una temperatura sostenida mínima de 10 a doce grados centígrados, en especial si cultivamos plantas de origen tropical (caña de azúcar, orquídeas, cedros, etc.)

·         La presencia de riegos de ultra bajo volumen (tipo niebla) es recomendable para automatizar  el sistema con sensores de humedad para activar el riego.

·         Telas media sombra, cámaras húmedas tipo caja Ward. Calefacción para el caso de especies tropicales

·         La temperatura debe sostenerse para que no caiga por debajo de los diez grados en especies de origen tropical como Caña de azúcar ( Saccharum officinarum  ) u orquídeas de invernadero cálido, Ejemplo: Phalaenopsis

·         Si  la aclimatación se ensaya en una cámara húmeda en el interior de un invernadero, las oscilaciones térmicas se ven disminuidas en el interior de dicha cámara.

·         Es preciso abrir todos los días las cámaras húmedas  para que se aireen y disminuya la humedad en el interior.

·         Estos tiempos de exposición también tienen que ser crecientes para ir logrando un endurecimiento de los tejidos cultivados previamente in vitro.

·         Los medios de cultivo deben esterilizarse para disminuir la exposición a posibles patógenos o contaminantes.

·         También el uso de fungicidas de suelos como el sulfato neutro de oxiquinoleína, mantiene la sanidad en los cultivos, aún en medios de cultivos orgánicos.

·         Para indicación general baste repetir que la rusticación es un proceso gradual y paulatino, nunca rápido, para lograr que plantas que estuvieron bajo condiciones controladas pasen a soportar las condiciones variables de la atmósfera.

·         13- BIBLIOGRAFIA

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